ردیابی و تعیین خصوصیات مولکولی ویروس لکه حلقوی بافت مرده هسته دارها prunus necrotic ringspot virus در استان های اصفهان و چهارمحال و بختیاری

درختان میوه هسته دار تحت تاثیر تعداد زیادی از ویروس ها قرار می گیرند که باعث خسارات اقتصادی قابل توجهی می شوند. ویروس لکه حلقوی بافت مرده هسته دارهاprunus necrotic ringspot virus (pnrsv) یکی از شایع-ترین ویروس های هسته دارها می باشد که از جنس ilarvirus و خانوادهbromoviridae بوده و انتشار جهانی دارد. این ویروس در مناطق معتدله جهان روی درختان میوه هسته دار شامل گیلاس، آلبالو، بادام، هلو، زردآلو، آلو و بسیاری از ارقام زینتی و وحشی گیلاس، هلو و آلو و برخی گونه های زینتی از قبیل رز گسترش دارد و سیب، زالزالک و گردو را نیز آلوده می کند. بعضی از جدایه های pnrsv در میزبان خود علایمی ایجاد نمی کنند ولی بروز لکه های کلروتیک و نکروتیک، لکه غربالی، پیچیدگی و بدشکلی برگ و صمغ زدگی در میوه، از علایم مشخص اغلب جدایه ها می باشد. این ویروس قبلا از بعضی مناطق ایران گزارش شده است ولی هیچ اطلاعات مولکولی از جدایه های ایرانی در دسترس نمی باشد. در این تحقیق به منظور ردیابی و تعیین برخی خصوصیات مولکولی ویروس لکه حلقوی بافت مرده هسته دارها، در بهار و تابستان سال های 1388 و 1389 از برگ درختان دارای علایم ویروسی از باغات استان های چهارمحال وبختیاری و اصفهان نمونه-برداری شد و بررسی آلودگی نمونه ها با استفاده از آزمون double antibody sandwich elisa (das elisa) و آنتی سرم چند همسانه ای pnrsv بررسی شد، همچنین تعدادی از نمونه ها نیز با استفاده از جفت آغازگر ilar1& ilar2 بصورت مستقیم تحت واکنش آزمون ic-rt-pcr قرار گرفتند. آلودگی تعداد قابل توجهی از نمونه ها در آزمون الیزا و ic-rt-pcr (باتکثیر قطعه مورد انتظار با اندازه bp 206) تایید شد. به منظور تکثیر ژن پروتئین پوششی ویروس جهت توالی یابی و انجام مقایسات مولکولی، تعدادی از نمونه های آلوده با استفاده از جفت آغازگر اختصاصی pnrsv? & pnrsv?? مورد بررسی قرار گرفتند. قطعات dna تکثیر شده با جفت آغازگرهای ilar1& ilar2 و pnrsv? & pnrsv?? همسانه سازی و تعیین توالی نوکلئوتیدی شدند. با توجه به گونه میزبان و منطقه جغرافیایی، نمونه های توالی یابی شده شامل شش جدایه آلبالو چم چنگ، بادام لردگان،بادام امامیه،بادام سامان، گیلاس فارسان و هلو نطنز بود. نتایج حاصل از blast توالی ها نشان دهنده ویروسی بودن قطعات تکثیر شده با جفت آغاز گرهای ilar1 & ilar2 و pnrsvi & pnrsvii و وجود همولوژی بالای آن ها با توالی جدایه های pnrsv موجود در بانک ژن بود. همچنین مشخص شد قطعه تکثیر شده با جفت آغاز گر pnrsvi & pnrsvii شامل توالی ژن پروتیین پوششی ویروس به استثنای 67 نوکلئوتید ناحیه ?5 آن می باشد. مقایسه توالی آمینواسیدی ژن پروتئین پوششی جدایه هایpnrsv ایرانی نشان داد که میزان تشابه بین جدایه ها از 5/96% تا 100% متغیر می باشد. جدایه آلبالو چم چنگ کمترین میزان تشابه (5/96%) را با بادام امامیه نشان داد. دو جدایه گیلاس فارسان و هلو نطنز نیز100% تشابه را نشان دادند. مقایسه توالی آمینواسیدی جدایه های ایرانی pnrsv با توالی های موجود در بانک ژن، تشابه بالای آنها را با توالی های دیگر جدایه های ویروس از سایر نقاط جهان نشان داد. بیشترین و کمترین میزان تشابه بین جدایه بادام لردگان به ترتیب با جدایه ای از ایتالیا ازهلو با رس شماره aj133205 (5/99%) و جدایه گیلاس از آمریکا با رس شماره af465235 (7/86%) بدست آمد. رسم درخت تبارزایی جدایه های ایرانی و جدایه های موجود در بانک ژن نشان دهنده قرار گرفتن آن ها در سه گروه فیلوژنتیک i، ii و iii بوده، به طوریکه جدایه های ایرانی در گروه فیلوژنتیک ii قرار گرفتند. همچنین هیچگونه همراهی بین منطقه جغرافیایی و میزبان مشاهده نشد. با توجه به اهمیت اقتصادی ویروس لکه حلقوی بافت مرده هسته دارها و شیوع بالای ویروس در استان های اصفهان و چهارمحال و بختیاری، انجام تحقیقات بیشتر روی این ویروس و استفاده از تکنیک های مختلف جهت عاری از ویروس نمودن نهال ها ضروری به نظر می رسد.